多肽合成方法

　　多肽合成方法：
 

　　1.酰基疊氮物法
 

　　早在1902年，Theodor Curtius就將?；B氮物法引入到肽化學(xué)中，因此它是最古老的縮合方法之一。在堿性水溶液中，除了與酰基疊氨縮合的游離氨基酸和肽以外，氨基酸酯可用于有機(jī)溶劑中。與其他許多縮合方法不同的是，它不需要增加輔助堿或另一等當(dāng)量的氨基組分來捕獲腙酸。
 

　　長(zhǎng)期以來，一直認(rèn)為疊氮物法是不發(fā)生消旋的縮合方法，隨著可選擇性裂解的氨基酸保護(hù)基引入，該方法經(jīng)歷了一次大規(guī)模的復(fù)興。該方法的起始原料分別是晶體狀的氨基酸酰肼或肽酰肼64,通過肼解相應(yīng)的酯很容易得到。在-10℃的鹽酸中，用等當(dāng)量的亞硝酸鈉使酰肼發(fā)生亞硝化而轉(zhuǎn)化為疊氮化物65,依次洗滌、干燥，然后與相應(yīng)的氨基組分反應(yīng)。有些疊氮化物可用冰水稀釋而沉淀出來。 二苯磷?；B氮化物(DPPA)也可以用于?；B氮化物的合成。Honzl-Rudinger方法采用亞硝酸叔丁作為亞硝化試劑，并且使疊氮縮合反應(yīng)可在有機(jī)溶劑中進(jìn)行。因酰基疊氮化物的熱不穩(wěn)定性，縮合反應(yīng)需在低溫下進(jìn)行。當(dāng)溫度較高時(shí)，Curtius重排，即?；B氮轉(zhuǎn)化為異氰酸酯的反應(yīng)成為一個(gè)主要的副反應(yīng)，最終導(dǎo)致生成副產(chǎn)物脲。由于反應(yīng)溫度低(如4℃)而導(dǎo)致反應(yīng)速率相當(dāng)慢，使得肽縮合反應(yīng)通常需要幾天才能*。  對(duì)于較長(zhǎng)的N端保護(hù)的肽鏈，酯基的肼解一般比較困難，因此，使用正交的N保護(hù)肼衍生物是一種選擇。在肼基的選擇性脫除后，按倒接(backing-off)策略組合的肽片段可以用于疊氮縮合。
 

　　如前所述，雖然疊氮法一直被認(rèn)為是消旋化傾向最小的縮合方法，但在反應(yīng)中，過量的堿會(huì)誘發(fā)相當(dāng)大的消旋。因此，在縮合反應(yīng)期間要避免與堿接觸，例如，氨基組分的銨鹽應(yīng)采用N，N-二異丙胺或N-烷基嗎啉代替三乙胺來中和。
 

　　雖然有上述局限性，但該方法仍很重要，尤其對(duì)于片段縮合而言，因?yàn)樵摲椒ň哂休^低的異構(gòu)化傾向，適用于羥基未保護(hù)絲氨酸或蘇氨酸組分時(shí)，Nˊ保護(hù)的本行酰肼還具有多種用途。
 

　　2.酸酐法
 

　　在多肽合成中，最初考慮應(yīng)用酸酐要追溯到1881年Theodor Curtius對(duì)苯甲?；被宜岷铣傻脑缙谘芯?。從氨基乙酸銀與苯甲酰氯的反應(yīng)中，除獲得苯甲酰氨基乙酸外，還得到了BZ-Glyn-OH(n=2-6)。早期曾認(rèn)為，當(dāng)用苯甲酰氯處理時(shí)，N-苯甲酰基氨基酸或N-苯甲酰基肽與苯甲酸形成了活性中間體不對(duì)稱酸酐。  大約在70年后，Theodor Wieland利用這些發(fā)現(xiàn)將混合酸酐法用于現(xiàn)代多肽合成。目前，除該方法外，對(duì)稱酸酐以及由氨基酸的羧基和氨基甲酸在分子內(nèi)形成的N-羧基內(nèi)酸酐(NCA,Leuchs anhydrides)也用肽縮合。最后應(yīng)該提到，不對(duì)稱酸酐常常參與生化反應(yīng)中的?；磻?yīng)。
 

　　3.混合酸酐法
 

　　有機(jī)羧酸和無機(jī)酸皆可用于混合酸酐的形成。然而，僅有幾個(gè)得到了廣泛的實(shí)際應(yīng)用，多數(shù)情況下，采用氯甲酸烷基酯。
 

　　由羧基組分和氯甲酸酯起始形成的混合酸酐，其氨解反應(yīng)的區(qū)域選擇性依賴依賴于兩個(gè)互相競(jìng)爭(zhēng)的羰基的親電性和(或)空間位阻。在由N保護(hù)的氨基酸羧酸鹽(羧基組分)和氯甲酸烷基酯(活化組分，例如源于氯甲酸烷基酯)形成混合酸酐時(shí)，親核試劑胺主要進(jìn)攻氨基酸組分的羧基，形成預(yù)期的肽衍生物，并且釋放出游離酸形式的活性成分。當(dāng)應(yīng)用氯甲酸烷基酯(R1=異丁基、乙基等)時(shí)，游離的單烷基碳酸不穩(wěn)定，立即分解為二氧化碳和相應(yīng)的醇。然而，對(duì)于親核進(jìn)攻的區(qū)域選擇性，也有一些相反的報(bào)道，產(chǎn)物為氨基甲酸酯和原來的N保護(hù)氨基酸組分。  為了形成混合酸酐，將N保護(hù)的氨基酸或肽分別溶于二氯甲烷、四氫呋喃、二氧六環(huán)、乙腈、乙酸乙酯或DMF中，用等當(dāng)量的三級(jí)堿(N-甲基哌啶、N-甲基嗎啉、N-乙基嗎啉等)處理。然后，在-15℃--5℃，劇烈攪拌的同時(shí)加入氯甲酸烷基酯以形成不對(duì)稱酸酐(活化)。經(jīng)短時(shí)間活化后，加入親核性氨基酸組分。如果作為銨鹽使用(需要更多的堿)，必須避免堿的過量使用。如果嚴(yán)格按照以上的反應(yīng)條件，混合酸酐法很容易進(jìn)行，是*的縮合方法之一。
 

　　4.對(duì)稱酸酐法
 

　　Nα-酰基氨基酸的對(duì)稱酸酐是用于肽鍵形成的高活性中間體。與混合酸酐法相反，它與胺親核試劑的反應(yīng)沒有模棱兩可的區(qū)域選擇性。但肽縮合產(chǎn)率最高，為50%(以羧基組分計(jì))。
 

　　雖然由對(duì)稱酸酐氨解形成的游離Nα-酰基氨基酸可以和目標(biāo)肽一起，通過飽和碳酸氫鈉溶液萃取回收，但在最初，這種方法的實(shí)用價(jià)值極低。對(duì)稱酸酐可以用Nα-保護(hù)氨基酸與光氣，或方便的碳二亞胺反應(yīng)制得。兩當(dāng)量的Nα-保護(hù)氨基酸與-當(dāng)量的碳二亞胺反應(yīng)有利于對(duì)稱酸酐的形成，對(duì)稱酸酐可以分離出來，也可不經(jīng)純化而直接用于后面的縮合反應(yīng)。基于Nα-烷氧羰基氨基酸的對(duì)稱酸酐對(duì)水解穩(wěn)定，可采用類似上述純化混合酸酐的方法進(jìn)行純化。
 

　　由于Boc-保護(hù)氨基酸的商品化和合理的價(jià)格，在肽鏈的逐步延長(zhǎng)中，使用對(duì)稱酸酐法日益受到重視。雖然可以買到晶狀的對(duì)稱酸酐，但原位制備仍然是一種不錯(cuò)的選擇。
 

　　5.碳二亞胺法
 

　　碳二亞胺類化合物可用于氨基和羧基的縮合。在該類化合物中N，Nˊ-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)相對(duì)便宜，而且可溶于肽合成常用的溶劑。在肽鍵形成期間，碳二亞胺轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的脲衍生物，N，Nˊ-二環(huán)己基脲可以從反應(yīng)液中沉淀出來。顯然，碳二亞胺活化后的活性中間體氨解和水解速率不同，使肽合成能在含水介質(zhì)進(jìn)行。經(jīng)幾個(gè)課題組的大量研究，確立了以碳二亞胺為縮合劑的肽縮合反應(yīng)機(jī)理，羧酸根離子加成到質(zhì)子化的碳二亞胺，形成高活性的O-?；澹浑m然還沒有分離出這個(gè)中間體，但通過非常類似的穩(wěn)定化合物推斷了它的存在。O-?；迮c氨基組分反應(yīng)，產(chǎn)生被保護(hù)的肽和脲衍生物。或者，與質(zhì)子化形式處于處于平衡狀態(tài)的O-?；愲?被第二個(gè)羧酸酯親核進(jìn)攻，產(chǎn)生對(duì)稱的氨基酸酐和N，Nˊ-二取代脲。前者與氨基酸反應(yīng)得到肽衍生物和游離氨基酸。在堿催化下，使用DCC的副反應(yīng)使?；鶑漠愲逖踉酉虻愚D(zhuǎn)移，產(chǎn)生N-?；?1,它不再發(fā)生進(jìn)一步的氨解。不僅過量的堿可催化O-N的酰基轉(zhuǎn)移，而且堿性的氨基組分或碳二亞胺也可催化該副反應(yīng)。